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本试剂盒包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在10～500kD的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。

本试剂盒配套有红色浓缩胶添加染料，凝固后的浓缩胶为红色，有利于在蓝色电泳缓冲液中观察加样孔，方便上样。电泳后可直接用于考染、银染、Western杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10～500kD范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝G-250代替SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白(pI＜7)；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。

本试剂盒大约可以配制8-25块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶浓度和厚度决定，1mm厚度8%凝胶可以配制至少10块胶。

本试剂盒不含样品制备的相关试剂，根据样品种类，具体选择不同提取方法。植物类囊体BN样品制备可以选择植物类囊体膜提取试剂盒(货号：RFT465)；动物总蛋白BN样品制备可以选择柱式动物胞浆蛋白提取试剂盒(货号：RFT464)；动物膜蛋白BN样品制备可以选择动物膜蛋白提取试剂盒(细胞样品选货号：RFT466)和动物膜蛋白提取试剂盒(组织样本选货号：RFT467)；动物线粒体BN样品制备可以选择动物线粒体提取试剂盒(细胞样本选货号：RFT468)和动物线粒体提取试剂盒(组织样本选货号：RFT469)。

• 分离胶制备
  
  • 不同浓度的分离胶的最佳分离范围：
    

    分离胶浓度	最佳分离范围
    6%	80～500kD
    8%	50～350kD
    10%	20～150kD
    12%	15～100kD
    15%	10～80kD

  • 根据表一，将不同体积的成分在小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    表一：Blue/Clear Native PAGE分离胶配方表(以一块1.0mm厚度mini胶为例)
    

    成分(mL)	分离胶总体积5mL
    	6%	8%	10%	12%	15%
    灭菌水	1.7	1.45	1.2	0.95	0.57
    2×BN/CN凝胶缓冲液	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
    40％ PAA(29:1)	0.75	1	1.25	1.5	1.875
    10％ APS	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
    TEMED	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

  • 在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整。
    
  • 静置15～30分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
• 浓缩胶制备
  
  • 去除覆盖在分离胶上的水层。
    
  • 按照表二将不同成分在一个小烧杯中混合，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
    表二：Blue/Clear Native PAGE浓缩胶（4%）配方表（以一块1.0mm厚度mini胶为例）
    

    成分	用量
    H2O	0.8mL
    2×BN/CN凝胶缓冲液	1mL
    40％ PAA(29:1)	0.2mL
    浓缩胶红色添加染料(200×)	10μL
    10％ APS	20μL
    TEMED	2μL

  • 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
    
  • 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
    
  • 静置30～60分钟，等待浓缩胶聚合。
    
    • 凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。

• 准备电泳缓冲液
  将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液(干粉)溶于500mL灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
  
  • CN-PAGE电泳：阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。
    
  • BN-PAGE电泳：阳极缓冲液(外槽)使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，1×蓝色阴极缓冲液(内槽)按照下表配制。
    

    成分	用量
    10×BN/CN PAGE电泳缓冲液	15mL
    2% G-250染料(电泳用)	1.5mL
    超纯水	定容至150mL

• 准备样品
  
  • CN-PAGE电泳：
    

    成分	用量
    蛋白样品	x μL
    4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5μL
    超纯水	至10μL
    不要加热。

  • BN-PAGE电泳：
    
    • 植物类囊体膜蛋白样品：
      

      成分	用量
      植物类囊体膜蛋白样品(2%DDM增溶)	x μL
      4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5μL
      5% G-250染料(蛋白上样)	1μL
      超纯水	至10μL
      不要加热。

      • 植物类囊体膜蛋白电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：植物类囊体样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。例如样品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM，n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）终浓度为2%，则需要G-250终浓度为0.5%。10μL蛋白样品中需要加5% G-250染料1μL。
    • 动物线粒体BN样品：
      

      成分	用量
      动物线粒体BN样品(1%DDM增溶)	x μL
      4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5μL
      5% G-250染料(蛋白上样)	0.25μL
      超纯水	至10μL
      不要加热。

      • 动物线粒体BN样品电泳中，含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：动物线粒体BN样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/8。例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.125%。10μL蛋白样品中需要加5% G-250染料0.25μL。
    • 不含去垢剂样品：
      

      成分	用量
      不含去垢剂样品	x μl
      4×BN/CN-PAGE蛋白上样缓冲液	2.5μL
      5% G-250染料(蛋白上样)	-
      超纯水	至10μL
      不要加热。

      • 不含去垢剂样品可以不必添加5%G-250染料。
• 电泳过程
  
  • CN-PAGE电泳：
    电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1mL吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。
    

    恒电压	起始电流	结束电流	电泳时间
    120V	10-15mA/板胶	4-10mA/板胶	50+min
    冰浴电泳

  • BN-PAGE电泳：
    BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达距离凝胶顶部2/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。
    BN-PAGE电泳条件（一板胶）
    

    恒电压	起始电流	电泳时间	缓冲液
    120 V	8-15 mA	20～25min	1×蓝色阴极缓冲液	冰浴电泳

    指示前沿至凝胶顶部三分之二处，更换内槽缓冲液为无色1×BN/CN电泳缓冲液。
    

    恒电压	继续电泳时间	结束电流	缓冲液
    120 V	45min +	3-5 mA	1×BN/CN电泳缓冲液
    冰浴电泳

• 转膜
  BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密。
  转膜缓冲液可以使用10×BN转膜缓冲液粉剂(货号：RFT461)。
  
• 染色
  
  • 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量QuickLan蛋白染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1～2分钟即可见。
    
  • 摇床常温摇动10～15分钟至条带清晰可见。
    
  • 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1～2次蒸馏水，摇床常温摇动10～15分钟至背景干净。
    
  • 观察保存结果。